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Quais fatores determinam a solubilidade de peptídeos?
Ocasionalmente, um dos aspectos mais difíceis da pesquisa com peptídeos sintéticos pode ser determinar o solvente mais eficaz para dissolvê-los. Muitos peptídeos se dissolvem facilmente em soluções aquosas (água estéril), mas alguns pesquisadores podem encontrar problemas relacionados à baixa solubilidade ou mesmo à insolubilidade, principalmente ao trabalhar com peptídeos que contêm longas sequências de aminoácidos hidrofóbicos. No entanto, os pesquisadores podem prever a solubilidade de qualquer peptídeo estudando as características conhecidas de seus aminoácidos individuais.
A solubilidade de um peptídeo é determinada principalmente pelas propriedades físicas de seus aminoácidos. Os aminoácidos podem ser classificados como básicos, ácidos, polares não carregados ou apolares. Os aminoácidos apolares são hidrofóbicos (não se dissolvem em soluções aquosas). Peptídeos contendo um número relativamente grande de aminoácidos apolares ou aminoácidos polares não carregados geralmente se dissolvem mais eficazmente em solventes orgânicos como DMSO, propanol, isopropanol, metanol ou DMF. Peptídeos com alto teor de aminoácidos ácidos geralmente podem ser dissolvidos em solventes básicos (como hidróxido de amônio, embora este não deva ser usado com peptídeos contendo cisteína) e, inversamente, peptídeos contendo um número relativamente alto de aminoácidos básicos geralmente podem ser dissolvidos eficazmente em solventes ácidos (como solução de ácido acético). No entanto, os pesquisadores devem sempre tentar dissolver os peptídeos em água estéril primeiro, especialmente quando o peptídeo contém menos de cinco resíduos (aminoácidos), pois esses peptídeos geralmente se dissolvem com bastante facilidade em água.
Diretrizes de solubilidade de peptídeos
Os pesquisadores devem sempre testar a solubilidade do peptídeo com uma pequena quantidade, caso a solubilidade ideal não seja alcançada inicialmente. Os peptídeos devem ser deixados em temperatura ambiente antes de se tentar dissolvê-los em solução. Se as tentativas de dissolver o peptídeo em solução aquosa estéril forem malsucedidas, os pesquisadores devem tentar soluções que possam ser removidas por liofilização; se esses solventes também não forem eficazes, eles podem ser removidos pelo processo de liofilização, permitindo que o pesquisador recomece sem perder ou comprometer o peptídeo.
Para auxiliar na solubilidade, pode-se utilizar um leve aquecimento da solução (menos de 40 graus Celsius ou 104 graus Fahrenheit) ou técnicas de sonicação. No entanto, essas técnicas apenas auxiliarão na dissolução; elas não alterarão as características de solubilidade inerentes a um peptídeo.
Previsão das características de solubilidade de peptídeos
Para prever as características de solubilidade de um determinado peptídeo, o pesquisador deve primeiro avaliar a composição de aminoácidos do peptídeo, visto que o número e os tipos de cargas iônicas no peptídeo influenciam a solubilidade. Especificamente, deve-se determinar se o peptídeo é ácido, básico ou neutro. Para isso, siga os seguintes passos:
1. Atribua o valor -1 aos resíduos ácidos (aminoácidos). Estes incluem Asp (D), Glu (E) e o grupo C-terminal (COOH).
2. Atribua o valor +1 a cada resíduo básico. Estes incluem Lys (K), Arg (R) e o grupo N-terminal NH2.
3. Atribua o valor +1 a cada resíduo de His (H) em pH 6.
4. Calcule a carga líquida total do peptídeo somando o número total de cargas do peptídeo.
Dissolvendo o peptídeo em solução
Após o cálculo da carga líquida total do peptídeo, é possível prever sua solubilidade e prosseguir com a dissolução do peptídeo em solução. É importante tentar dissolver o peptídeo primeiro em solução aquosa estéril. Caso a água não seja eficaz, siga as seguintes orientações:
• Se a carga líquida total do peptídeo for positiva, tente dissolvê-lo em uma solução de ácido acético (10%–30%). Se isso não funcionar, tente com TFA (< 50 μl).
• Se a carga do peptídeo for negativa, tente dissolvê-lo com hidróxido de amônio (NH4OH; < 50 μl). No entanto, se o peptídeo contiver cisteína, não use hidróxido de amônio; em vez disso, adicione uma pequena quantidade de DMF.
• Se o peptídeo for neutro (carga líquida total de 0), os solventes orgânicos geralmente são mais eficazes. Tente acetonitrila, metanol ou isopropanol. Se o peptídeo for altamente hidrofóbico, tente dissolvê-lo em uma pequena quantidade de DMSO. Cuidado: peptídeos que contêm cisteína, metionina ou triptofano são propensos à oxidação pelo DMSO. Além disso, alguns peptídeos tendem a se agregar (formar gel); para esses peptídeos, adicione guanidina•HCl 6 M ou ureia 8 M.
Após a dissolução bem-sucedida do peptídeo, dilua a solução até a concentração desejada, adicionando-a lentamente a uma solução tampão. Utilize agitação suave, porém constante, durante a mistura para monitorar visualmente e evitar a concentração localizada do peptídeo na solução aquosa. Recomenda-se preparar a solução estoque do peptídeo em uma concentração superior à necessária para o ensaio experimental: a solução estoque pode então ser diluída posteriormente com o tampão de ensaio.
Após o preparo da solução peptídica, aliquotas devem ser divididas conforme necessário e armazenadas a -20 °C (-4 °F). Para peptídeos que contenham cisteína, metionina ou triptofano, previna danos por oxidação armazenando-os em ambiente livre de oxigênio.